1） 購買的限制性內(nèi)切酶帶有兩種不同的酶切緩沖液，該用哪一種？
每種限制性內(nèi)切酶帶有一管酶的zui適反應(yīng)液（通常是一種4-CORE反應(yīng)液），可能還帶有一只MULTI-CORE反應(yīng)液。 |
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2） 4-CORE酶切緩沖液體系是什么？
大多數(shù)（大約75%）Promega公司的限制性內(nèi)切酶有一種zui適酶切緩沖液，即4-CORE酶切緩沖液，分別叫作A、B、C和D。其余的25%的限制性內(nèi)切酶帶有一種特定的酶切緩沖液（酶切緩沖液E-L）。每一種限制性內(nèi)切酶帶有一只zui適酶切緩沖液。 |
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3） MULTI--CORE酶切緩沖液體系是什么？
MULTI--CORE酶切緩沖液適用于雙酶切。每一種Promega公司的限制性內(nèi)切酶都測試了在MULTI--CORE酶切緩沖液中的活力，如果酶切活力達(dá)25%，就提供一只MULTI--CORE酶切緩沖液。作雙酶切時(shí)，如果兩個(gè)酶在MULTI--CORE酶切緩沖液中的活力達(dá)到50-100%，就可替代A-L酶切緩沖液。應(yīng)選用酶活力zui高的酶切緩沖液。 |
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4） 如何保存限制性內(nèi)切酶？
不太常用的限制性內(nèi)切酶多保存在-70oC,每周或每天用的酶保存在-20oC。有一些酶需要不同的保存條件。每一種Promega公司的限制性內(nèi)切酶都提供一份分析說明以供查訊。使用限制性內(nèi)切酶時(shí)，應(yīng)將酶保存在冰上。 |
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5） 一般的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)中（也叫消化），應(yīng)用多少內(nèi)切酶？
所用的酶量取決于DNA的純度、量和型態(tài)。限制性內(nèi)切酶的活力單位定義為在適當(dāng)?shù)臏囟认拢?小時(shí)內(nèi)，1ugDNA在50ul體積中，被*消化所需的限制性內(nèi)切酶的量。一般說來，線性DNA比超螺旋DNA更易消化。比如，酶切1uglambdaDNA，需要1-2單位的酶，而酶切1ug質(zhì)粒DNA，需要3-5單位的酶。 |
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6） 使用限制性內(nèi)切酶的一般步驟是什么？
一般步驟如下：
A）測試酶切DNA的量
B）計(jì)算*酶切所需的酶量。為使終體積中甘油的濃度低于8%，計(jì)算能加的酶量，zui多能加終體積的10%（甘油的濃度為5%）。
C）10X反應(yīng)液的體積應(yīng)為終體積的1/10；10X反應(yīng)液的體積不應(yīng)小于酶的體積。
D）加入計(jì)算好的DNA，10X反應(yīng)液，酶。
加入水到終體積（20-50 ul），輕輕混勻，在適當(dāng)?shù)臏囟认卤?。一般酶的zui適溫度為37 oC，但有例外。應(yīng)查訊分析說明。
比如：
質(zhì)粒DNA （2ug/ ul） 5 ul
10X反應(yīng)液 5 ul
酶（5ug/ ul） 5 ul
dH2O 35 ul
50 ul
37 oC保溫2-3小時(shí)。
應(yīng)zui后加酶。 |
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7） 一次使用兩個(gè)限制性內(nèi)切酶的一般步驟是什么（比如雙酶切）？
一次使用兩個(gè)限制性內(nèi)切酶的一般步驟，如同使用一個(gè)限制性內(nèi)切酶的一般步驟。但要注意兩個(gè)限制性內(nèi)切酶在同一種緩沖液中都要有活力。甘油的濃度不應(yīng)超過終體積的8%。應(yīng)注意有些酶對末端敏感，活力差。 |
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8） 能否在一次反應(yīng)中用很多的限制性內(nèi)切酶？
可以，一般而言，甘油濃度超過8%對酶切有抑制。有些酶在高的甘油濃度中會(huì)產(chǎn)生星活力。限制性內(nèi)切酶提供在50%的甘油中，故10 ul反應(yīng)體積中不應(yīng)加入超過1.6 ul的酶。 |
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9） 消化反應(yīng)中是否需要加牛血清白蛋白（BSA）？
不需要。酶切不需要加BSA。但Promega公司的限制性內(nèi)切酶活力測定時(shí)，均加入乙?；腂SA達(dá)0.1mg/ml。BSA可以提高許多限制性內(nèi)切酶活力。Promega公司的限制性內(nèi)切酶均提供一管乙酰化的BSA（R396D，E，F(xiàn)），并建議酶切時(shí)加入BSA達(dá)0.1mg/ml。 |
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10） 星活力是什么？
星活力是指在保溫條件改變，如NaCl過多存在于反應(yīng)液中，使酶切的核酸序列不同于它特定的識別序列。 |
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11） 什么是同切酶？
同切酶指兩個(gè)酶的識別位點(diǎn)和酶切位點(diǎn)相同，如 Sph I（CGTAC'G）和 Bbu I（CGTAC'G）互為同切酶。 |
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12） 什么是neoschizomer？
Neoschizomer指兩個(gè)酶的識別序列相同，但酶切位點(diǎn)不同，如 Sma I（GGG'CCC）和 Xma I（G'GGCCC）互為neoschizomer。 |
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13） 基因組規(guī)格指的是什么？
基因組規(guī)格的酶適用于酶切包裹在瓊脂中的基因組DNA。另外，染色體DNA的制備、酶切和凝膠分離的條件對基因組規(guī)格的酶作了優(yōu)化。 |
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14） 如果一個(gè)限制性內(nèi)切酶不是基因組規(guī)格，是否表明它不能用于處理染色體DNA？
不一定。如果一個(gè)限制性內(nèi)切酶不是基因組規(guī)格,Promega公司沒有測試它能否處理包裹的基因組DNA。因此需作一些測試來決定酶是否會(huì)切割底物。 |
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15） 需要用多少單位的限制性內(nèi)切酶對瓊脂包裹的染色體DNA進(jìn)行酶切？
切割包裹的DNA比普通底物需要更多的酶，一般需要多2倍。 |
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16） 什么是藍(lán)/白克隆測試？
藍(lán)/白克隆測試是一種確定酶切樣品中，存在的少量外切核酸酶活力的質(zhì)量檢查過程。通過測定一個(gè)功能基因（Beta-半乳糖苷酶）酶切和重新連接后，藍(lán)/白斑的比例，來確定外切核酸酶活力。如果存在少量外切核酸酶活力，或不存在外切核酸酶活力，得到的是藍(lán)色菌落。產(chǎn)生粘性末端的酶實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的白色菌落應(yīng)小于2%，而產(chǎn)生平頭末端的酶實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的白色菌落應(yīng)小于5%。這個(gè)方法的靈敏度很高，可以檢測出缺失一個(gè)堿基的酶切末端。 |
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17） 限制性內(nèi)切酶是如何命名的？
限制性內(nèi)切酶命名的次序如下：
A） 用3個(gè)字母代表來源的生物（如 Bam 代表 Bacillus amyloliquefaciens ）
B） 1個(gè)字母或阿拉伯?dāng)?shù)字代表菌株（ Bam H）
C） 1個(gè)羅馬字母代表發(fā)現(xiàn)或鑒定的次序（ Bam HI） |
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18） 如何稀釋限制性內(nèi)切酶？
如果1小時(shí)內(nèi)會(huì)使用限制性內(nèi)切酶，可用補(bǔ)充有0.5mg/ml BSA的1X反應(yīng)液稀釋，如果在更長的時(shí)間內(nèi)才會(huì)使用限制性內(nèi)切酶，用酶貯存液稀釋。 |
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19） 如何查訊一種限制性內(nèi)切酶在特定條件下活力的資料？
請查尋 Restriction Enzyme Properties 。 |
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