酶切出現(xiàn)問題，先看內(nèi)切酶說明書，相應(yīng)試劑公司目錄。不同公司出產(chǎn)的內(nèi)切酶，菌株來源、制備工藝、純度活力、酶切活性優(yōu)化可能不同，酶切效果也有差別。可在上面找到酶單位定義、保存條件、酶切體系[buffer及與其它酶雙切的buffer等]、酶切反應(yīng)溫度[有些酶是在50、55或30等溫度下反應(yīng)的]、酶是否受甲基化影響、是否有星號(hào)活性及出現(xiàn)星號(hào)活性可能因素、保護(hù)性堿基，同尾酶、同裂酶等等。   

1. 酶切不開或不*
1.1 質(zhì)粒問題：純度差或殘留酶切抑制物zui為常見。雜蛋白存在會(huì)影響酶切，表現(xiàn)為A260/A280低于1.8；抑制物常見酚、鹽、乙醇等。[重新提DNA，使用可靠試劑盒或可靠手工提取試劑]
1.2 酶的問題：確認(rèn)內(nèi)切酶有效 [很多內(nèi)切酶雖然有過期時(shí)間，但過期后只要能夠有效酶切，可用。確認(rèn)酶切效果不好，做標(biāo)記，更換] 。

【題外話：用內(nèi)切酶注意】
a. 內(nèi)切酶如無特殊要求，保存-20~-30度。并非越低越好，酶通常是保存在50％甘油緩沖液中，溫度過低時(shí)，酶會(huì)發(fā)生凍結(jié)（運(yùn)輸過程例外，由于酶需要低溫運(yùn)輸，所以方便的情況下是使用干冰，酶會(huì)凍結(jié)，但凍結(jié)次數(shù)有限，相對(duì)是一種比較好的選擇），如果是經(jīng)常使用的話，酶會(huì)被反復(fù)凍融，從而降低了活性。當(dāng)然如果溫度過高，呵呵，你就自己想去吧。

b. 酶在使用時(shí)應(yīng)置于冰盒中取酶。這點(diǎn)大家都清楚，不過多強(qiáng)調(diào)也沒壞處。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室有些同學(xué)，酶取出后是放在冰盒上的，但有兩點(diǎn)忽略了：拿酶的時(shí)候，手不是抓著管子上端，而握在管子的底部，相當(dāng)于用手在給酶進(jìn)行加熱；有些酶是放在冰盒中，但吸酶的時(shí)候，還是將酶拿出來。偶爾一次沒有大礙，反復(fù)如此，可能會(huì)影響酶活。

c. 酶使用完后應(yīng)盡快旋緊蓋子。有時(shí)我們可以發(fā)現(xiàn)，即使是-20~-30度放置，酶仍然會(huì)凍結(jié)。個(gè)人認(rèn)為的可能原因是由于在配置酶切反應(yīng)時(shí)，酶管的蓋子在較長(zhǎng)時(shí)間的開著，甘油會(huì)吸取空氣中的水分，對(duì)于常用的大包裝的酶有時(shí)就會(huì)出現(xiàn)凍結(jié)現(xiàn)象。此外，有時(shí)由于操作不小心，冰盒上凝結(jié)的一些碎冰掉在酶管里了（我自己出現(xiàn)過兩次，汗....）

d. 吸取酶時(shí)的tips。我們常用來取酶的tips都是zui小的那種，適合2ul和10ul的槍，但tips通常有兩種，一種是zui常用的短的tips，用它取酶時(shí)，tips挨著酶液后，槍幾乎是要插入管子，有時(shí)會(huì)在槍身上沾上酶液。因此，可能會(huì)產(chǎn)生污染。那么我們必要非常注意動(dòng)作，要么就換用另一種長(zhǎng)的 tips，專門取酶液用。

1.3 buffer問題。有些酶切的buffer中，添加了一些較為容易析出或溶解的成分[連接酶的buffer更是這樣]，有時(shí)酶切的buffer沒有*融化時(shí)，buffer的濃度是不均一的。新的buffer先融化的部分，鹽離子濃度要高，使用一段時(shí)間后，融化部分的離子濃度會(huì)變低。通常，這種影響不大，但如果是使用一些對(duì)離子濃度敏感的內(nèi)切酶時(shí)就會(huì)出現(xiàn)問題。

1.4 雙酶切的buffer選擇：確認(rèn)使用的是正確的buffer和反應(yīng)溫度[具體可以參考各廠家提供的酶切buffer以及雙酶切buffer的資料，其中，NEB的可以參見
http://www.neb-china.com/cn/tech/re/double_digests.htm

1.5 酶切位點(diǎn)的甲基化影響：有時(shí)甲基化會(huì)影響酶切，常見的有Xba I、Bcl I 等。甲基化主要分為Dam、Dcm和CpG甲基化等。如果是提取的質(zhì)粒，質(zhì)粒就會(huì)因大腸桿菌的Dam、Dcm被甲基化；如果是直接從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中提取的DNA，則部分DNA就會(huì)因CG methylase的影響而被甲基化。一些酶切位點(diǎn)被甲基化后，酶切會(huì)受影響。因此，出現(xiàn)酶切不開或不全時(shí)需要考慮甲基化的問題。甲基化通常出現(xiàn)在特定序列，以Xba I為例，僅當(dāng)序列位5'-【TCTAGA】TC-3'時(shí)，Xba I的位點(diǎn)才會(huì)被甲基化，并非所有的Xba I位點(diǎn)都會(huì)出現(xiàn)甲基化。
具體的列表可以參考
http://www.biocolors.com.cn/en/gsxw_p.asp?N_id=12
http://bio.takara.co.jp/BIO_EN/catalog_d.asp?C_ID=C0007
http://www.neb-china.com/cn/tech/re/alteration.htm

其中，克隆常用的酶切位點(diǎn)見下表：
Restriction Enzyme  Methylation
Sequence &Site  Methylation Type  Enzyme Activity Blocked?
AarI  5'...CACCTG cG...3'  C  partially
ApaI  5'...GGGCC cG...3'  C  partially
ApaI  5'...GGGCCc WGG...3'  D  partially
BclI  5-TGaTCA...3'  A  Compley
BglI  5'...GCC（N）5GG cG...3'  C  partially
BglI  5'...GCc WGGNNGGC...3'  D  Compley
Esp3I  5'...CGTCTC...3'  E  Compley
HincII  5'...GTYRA cG...3'  C  partially
HinfI  5'...GANT cG...3'  C  partially
HpaII  5'...CCGG...3'  E  Compley
HphI  5'...GGTGa TC...3'  B  Compley
MboI  5'...GaTC...3'  A  Compley
NheI  5'...GCTAG cG...3'  C  partially
NmuCI  5'...GTCA cG...3'  C  partially
NotI  5'...GCGGCCGC...3'  E  Compley
PvuI  5'...CGATCG...3'  E  Compley
RsaI  5'...GTA cG...3'  C  partially
SalI  5'...GTCGAC...3'  E  Compley
SatI  5'...G cG GC...3'  C  Compley
SmaI  5'...CCCGGG...3'  E  Compley
XbaI  5'...TCTAGa TC...3'  B  Compley
XhoI  5'...CTCGAG...3'  E  partially

Type A: a - N6-methyladenine （m6A）
Type B: a - N6-methyladenine （m6A）, Partially Overlap Dam Methylase Site GATC
Type C: c - 5-methylcytosine （m5C），Overlap CG
Type D: c - 5-methylcytosine （m5C） ，Partially Overlap Dcm Methylase Site CCWGG
Type E: m5CG or m5CNG（這種修飾主要發(fā)生在植物和動(dòng)物來源的DNA）

1.6 酶切體系問題：通常較大的反應(yīng)體系（>=50ul），較少量的質(zhì)粒（<=1ug,或更少），酶切的會(huì)更加*一些。

1.7 酶切或雙酶切時(shí)，保護(hù)性堿基及近末端位點(diǎn)堿基個(gè)數(shù)的問題。在酶切PCR產(chǎn)物時(shí)，酶切位點(diǎn)旁的堿基個(gè)數(shù)可能會(huì)影響酶切效率。同樣，在雙酶切載體時(shí)，如果兩個(gè)載體相鄰過近，也有可能會(huì)影響酶切效果。這個(gè)問題以前也曾有討論，具體可以參考
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=154&id=8577107&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#8577107
關(guān)于相關(guān)的資料可以參見：
http://www.neb-china.com/cn/tech/re/cleavage_olig.htm [針對(duì)PCR產(chǎn)物酶切位點(diǎn)保護(hù)性堿基的資料]
http://www.neb-china.com/cn/tech/re/cleavage_vector.htm [針對(duì)載體酶切位點(diǎn)近末端位點(diǎn)堿基個(gè)數(shù)對(duì)酶切影響的資料]

2. 質(zhì)粒酶切時(shí)出現(xiàn)smear。
2.1 體系中的內(nèi)切酶含量過高：通常酶切體系中的內(nèi)切酶含量不宜超過酶切體系的10％，不管是單一酶切還是雙酶切，酶的含量在5％以下是比較合適的。由于酶是保存在50％甘油緩沖液中，過高的酶用量會(huì)導(dǎo)致甘油含量提高，而從引起酶的星活性；

2.2 酶切反應(yīng)過程中有導(dǎo)致星活性的因素：有些內(nèi)切酶除了對(duì)甘油濃度外，對(duì)離子濃度、反應(yīng)溫度、酶含量、反應(yīng)時(shí)間等都可能產(chǎn)生星活性。所以在使用內(nèi)切酶時(shí)，一定要留意說明書中的描述，避免可能出現(xiàn)星活性情況的發(fā)生。減少酶用量、合適的反應(yīng)溫度、不進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的酶切反應(yīng)，可減少星活性的出現(xiàn)。

2.3 酶切體系可能污染了其它物質(zhì)：如其它的DNA、其它的內(nèi)切酶或DNA酶等。

參考貼：
限制性內(nèi)切酶的熱失活：http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=154&id=8893410&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=1#8893410
內(nèi)切酶星號(hào)活性：http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=154&id=8893487&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=1#8893487
限制性內(nèi)切酶保護(hù)堿基：http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=154&id=8893511&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=1#8893511

進(jìn)37度之前，用vortex或移液槍混一下更好，能把壁上的液體旋掉!